ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T28067—2011 甘 蔗黄叶病毒实时荧光RT-PCR检测方法 Detectionofsugarcaneyellowleafvirususingthereal-timeRT-PCR 2011-12-30发布 2012-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:福建农林大学甘蔗综合研究所、农业部甘蔗及制品质量监督检验测试中心、农业 部甘蔗遗传改良重点开放实验室。 本标准主要起草人:高三基、陈平华、陈如凯、郭晋隆、张华、许莉萍、王恒波、陈由强。 ⅠGB/T28067—2011 甘蔗黄叶病毒实时荧光RT-PCR检测方法 1 范围 本标准规定了甘蔗黄叶病毒实时荧光RT-PCR检测方法所需的仪器与试剂、样品的采集与前处 理、操作方法以及结果判定。 本标准适用于甘蔗植株、种苗及种茎中甘蔗黄叶病毒的快速检测、诊断。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 反转录 reversetranscription 以RNA为模板合成DNA的过程,也称逆转录。 2.2 实时荧光RT-PCR realtimeRT-PCR 实时荧光反转录-聚合酶链式反应。 2.3 Ct值 cycletime 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 RNA:核糖核酸 Taq酶:TaqDNA聚合酶 dNTPs:4种脱氧核苷5′-三磷酸混合液 RNase:RNA酶 M-MLV:莫洛尼鼠白血病病毒(Moloneymurineleukeminvirus)反转录酶 FAM:6-羧基荧光素 TAMRA:6-羧基四甲基罗丹明 4 方法原理 在反转录酶作用下将RNA反转录成cDNA,再以cDNA为模板利用Taq酶进行实时荧光PCR扩 增反应(采用TaqMan探针方法)。在比对甘蔗黄叶病毒外壳蛋白基因的基础上,设计一对仅在甘蔗黄 叶病毒外壳蛋白基因间保守的特异性引物和一条特异性的荧光双标记探针。探针的5’端标记FAM荧 光素为报告荧光基团,3’端标记TAMRA荧光素为淬灭荧光基团,结合部位位于目的扩增片段内部。 当完整的探针与目的序列配对时,荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭剂接近而被淬灭,仪器检测不 到荧光信号;但在进行延伸反应时,Taq酶发挥5’→3’的外切核酸酶功能,将探针降解,使得荧光基团 1GB/T28067—2011 与淬灭剂分离,所发出的荧光不再为淬灭剂所吸收而被检测仪所接受。随着扩增循环数的增加,释放出 来的荧光基团不断积累。因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系。 5 甘蔗黄叶病毒基本信息 5.1 病毒粒体形态特征 甘蔗黄叶病毒粒体为二十面对称体,直径24nm~29nm,浮力密度1.30g/cm3,由蛋白质外壳及 其包裹着的一条单链、正义的RNA(ssRNA)构成,病毒基因组大小约6kb。 5.2 寄主范围 自然寄主为甘蔗属中的热带种(Saccharumofficinarum)、大茎野生种(Saccharumrobustum)、中国 种(Saccharumsinensis)和割手密(Saccharumspontaneum)。 实验寄主包括蔗茅属(Erianthussp.)、小麦、燕麦、大麦、水稻、玉米和高粱等。 在寄主植株内的分布主要局限于组织韧皮部内。 5.3 寄主症状 田间病症表现为甘蔗叶片中脉黄化,并向两侧扩展,中脉下表皮为鲜黄色,上表皮仍是正常的白色 或绿白色,有的染病品种叶片中脉两侧出现红褐色。染病植株叶片从叶尖开始干枯坏死,并向下扩展, 严重感病植株叶片发黄、坏死。由甘蔗黄叶病毒引起的这种病害称为甘蔗黄叶病(Sugarcaneyellow leafdisease),早期称为甘蔗黄叶综合症(sugarcaneyellowleafsyndrome)。 5.4 分布地区 甘蔗黄叶病1989年首次发生在美国夏威夷,随后陆续在美国的弗罗里达州、德克萨斯州、路易斯安 那州以及巴西、澳大利亚、南非、中国、印度等30多个国家和地区出现并不断蔓延扩大。 5.5 传播途径 由甘蔗蚜虫(Melanaphissacchari)、甘蔗绵蚜(Ceratovacunalanigera)、玉米叶蚜(Rhopalosiphum maidis)和水稻根际蚜虫(Rhopalosiphumrufiabdominalis)传播,也可由感病的种茎传播,但不能通过 种子、机械摩擦方式传播。 6 病毒的分类信息 国际病毒分类委员会(ICTV)第8次报告将甘蔗黄叶病毒列入黄症病毒科(Luteoviridae)马铃薯卷 叶病毒属(Polerovirus)中成员,英文名称为sugarcaneyellowleafvirus,缩写为SCYLV。 7 仪器与设备 7.1 实时荧光PCR检测系统。 7.2 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 7.3 电子天平:感量0.01g。 7.4 高速台式冷冻离心机:离心力12000g以上。 2GB/T28067—2011 7.5 微量加样器:0.1μL~2.5μL,0.5μL~10μL,5μL~20μL,10μL~100μL,10μL~200μL, 100μL~1000μL。 7.6 无RNA酶的离心管、PCR反应管、Tip头、实时荧光PCR反应管。 7.7 恒温水浴锅。 7.8 鼓风干燥箱。 7.9 冰箱:2℃~4℃,-20℃,-80℃。 8 试剂与材料 8.1 试剂 除另有规定外,所用试剂均为分析纯或生化试剂;所有试剂均用无RNA酶的容器分装。 8.1.1 三氯甲烷。 8.1.2 异丙醇。 8.1.3 75%乙醇1)。 1) 用无RNase水配制。8.1.4 无RNase水及双蒸水。 8.1.5 裂解液:主要成分为异硫氰酸胍和苯酚,为RNA提取试剂。 8.1.6 5×反转录反应混合液:含5×反转录反应缓冲液、dNTPs、RNase抑制剂、M-MLV反转录酶, 具体配制方法参见附录A。 8.1.7 检测引物 5’-引物:5’-TTCAGTATAACTCATGCTCCTCCG-3’ 3’-引物:5’-ACTTTCTTGGCGTTCCTCTTG-3’ 扩增片段大小为130bp。 8.1.8 TaqMan探针:5’-FAM-CGCAACTCCAGGTGCAATCGC-TAMRA-3’。 8.1.9 含有EXTaq荧光PCR反应混合液 含有2×EXTaq荧光PCR反应液、5’-引物、3’-引物、TaqMan探针,具体配制方法参见附录A。 8.2 材料 8.2.1 阳性对照:用已知含甘蔗黄叶病毒的样品作阳性对照。 8.2.2 阴性对照:用已知不含甘蔗黄叶病毒的样品作阴性对照。 9 样品的采集与前处理 9.1 取样工具 砍刀、剪刀、镊子等取样工具应经121℃±2℃、1.1×105Pa高压灭菌15min或经160℃干烤 2h。 9.2 采样方法 9.2.1 采样过程中应避免样本交叉污染,采样及样品前处理过程中应戴一次性手套。 9.2.2 叶片样品:取甘蔗植株或种苗最高可见肥厚带叶上一叶(-1叶)叶片,编号备用。 3GB/T28067—2011 9.2.3 蔗茎样品:取甘蔗植株可见肥厚带叶下两叶(+3叶)对应的蔗茎,若为甘蔗蔗种,取中部种茎, 编号备用。 9.3 存放与运送 采集或处理的样本在2℃~8℃条件下保存应不超过24h;若需长期保存,要求放置-80℃冰箱, 但应避免反复冻融。采集的样品密封后,采用保温壶或保温桶加冰密封,或用液氮处理,尽快运送到实 验室。 10 操作方法 10.1 总RNA的提取 10.1.1 取1.5mL无RNA酶的离心管,并对每个管进行编号。 10.1.2 称取0.2g样品材料(蔗茎样品要去除表皮),并用液氮研磨成粉末状(要保持液氮不挥发干 净)。 10.1.3 向1.5mL离心管中加入粉末,等液氮刚挥发完立即加入1mL裂解液,盖上管盖,振荡混匀, 于4℃、12000g离心10min。 10.1.4 吸取上清液至另一新的离心管中,加入0.2mL三氯甲烷,盖住管盖,剧烈振荡混匀约15s,室 温静置3min后,于4℃、12000g离心15min。 10.1.5 吸取上清液至另一新的离心管中,加入0.5mL预冷的异丙醇(-20℃),颠倒混匀,室温静置 10min后,于4℃、12000g离心15min(离心管开口保持朝离心机转轴方向放置)。 10.1.6 小心倒出离心管中上清液,加入1mL75%预冷的乙醇(-20℃)洗涤,颠倒离心管2次~3次, 7500g离心5min(离心管开口保持朝离心机转轴方向放置)。重复洗涤沉淀1次。 10.1.7 小心倒出离心管中上清液,用微量加样器将其吸干,一份样本换用一个吸头,吸头不要碰到有 沉淀的一面,室温干燥10min~15min。 10.1.8 加入50μL无RNase水,轻轻混匀,溶解管壁上的RNA,2000g离心5s,冰上保存备用。提 取的RNA应在2h内进行RT-PCR扩增;若需长期保存,应放置-80℃冰箱。 10.1.9 取5μLRNA溶液加无RNase水稀释至1mL,使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计上测 260nm和280nm处的吸光值A260和A280。RNA浓度按式(1)计算: c=A×N×40/1000 …………………………(1) 式中: c———RNA浓度,单位为微克每微升(μg/μL); A———260nm处的吸光