ICS65.150 B50 中华人民共和国国家标准 GB/T32757—2016 贝类染色体组型分析 Molluscskaryotypeanalysis 2016-06-14发布 2017-01-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国水产标准化技术委员会(SAC/TC156)归口。 本标准起草单位:中国水产科学研究院黄海水产研究所、威海市环翠区海洋与渔业研究所、山东省 海水养殖研究所。 本标准主要起草人:张岩、张辉、刘琪、张豫、潘婷、马爽、原永党。 ⅠGB/T32757—2016 贝类染色体组型分析 1 范围 本标准给出了贝类染色体组型分析的方法原理、仪器和设备、玻片标本的制备和组型分析方法。 本标准适用于贝类染色体组型分析。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T18654.12 养殖鱼类种质检验 第12部分:染色体组型分析 3 术语和定义 GB/T18654.12界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 3.1 胚胎法 earlyembryomethod 利用贝类胚胎为材料分析其染色体组型的方法。 3.2 担轮幼虫法 trochophoramethod 利用贝类担轮幼虫为材料分析其染色体组型的方法。 3.3 成体鳃组织法 gilltissuemethod 利用贝类成体鳃组织为材料分析其染色体组型的方法。 3.4 异形染色体 heteromorphicchromosomes 形态不同的一对同源染色体。 3.5 次缢痕 secondaryconstriction 染色体上部分DNA松懈形成核仁组织区的缢缩部位。 3.6 随体 satellite,trabant 通过次缢痕与染色体主要部分相连,位于染色体末端的、圆形或圆柱形的染色体片段。 4 原理 利用PHA等增加细胞分裂相、秋水仙素破坏细胞中的纺锤丝,采用怒同方法制备染色体玻片标 本,获得数目完整、形态清晰的染色体图像,用于染色体组型分析。 1GB/T32757—2016 5 药品和试剂 5.1 氯化钾(KCl):分析纯。 5.2 甲醇(CHOH):分析纯。 5.3 冰乙酸(C2H4O2):分析纯。 5.4 二甲苯[C6H4(CH3)2]:分析纯。 5.5 中性树胶。 5.6 秋水仙素溶液:注射液用生理盐水配制,处理液用蒸馏水或海水配制,4℃避光保存。 5.7 0.075mol/L氯化钾溶液:称取5.59g氯化钾,定容至1000mL。 5.8 25%海水:取洁净的过滤海水,用蒸馏水稀释至25%。 5.9 植物血球凝集素(PHA)溶液:用生理盐水稀释至适宜的浓度。 5.10 卡诺氏(Carnoy's)固定液:3份甲醇加入1份冰乙酸(体积比),现用现配。 5.11 磷酸缓冲液(PBS):浓度为0.2mol/L,pH值为7.2,量取0.2mol/L的磷酸氢二钠(Na2HPO4) 72mL和0.2mol/L的磷酸二氢钠(NaH2PO4)28mL,混合均匀。 5.12 吉姆萨(Giemsa)染液:称取0.5gGiemsa粉、甘油33mL,在研钵内用少量甘油与Giemsa粉混 合,研磨至无颗粒时,再加入剩余的甘油,56℃条件下保温2h后,加入33mL甲醇,过滤保存于棕色瓶 内,使用前用PBS稀释10倍。 5.13 2%醋酸洋红:先将100mL45%乙酸水溶液置入200mL的锥形瓶中煮沸,停止加热,然后慢慢 地分多次加入2g洋红粉末(切记不可一次倒入)。待全部倒入后,再煮沸1min~2min,并悬入一生锈 的小铁钉于染液中,过1min后取出,静置12h后过滤于棕色瓶中置于避光处备用。 5.14 卡宝品红(Carbolfuchsin)改良液: A液:3g碱性品红溶于100mL70%乙醇,可长期保存; B液:10mLA液加入90mL5%苯酚水溶液,限14d内使用; 染色母液:B液45mL,37%甲醛6mL,冰乙酸6mL; 卡宝品红改良液:染色母液10mL,45%乙酸90mL,山梨醇1g,放置2周后使用。 5.15 醋酸地衣红:取100mL45%的乙酸煮沸,慢慢加入地衣红至饱和,冷却后过滤。 5.16 醋酸铁苏木精水合氯醛染色液: A液:2g苏木精溶解在100mL45%冰乙酸中; B液:0.5g铁铵明矾[FeNH4(SO4)212H2O]溶解在100mL45%冰乙酸中。 染色液:使用前一天将A液和B液等体积混合,每5mL中溶入2g水和氯醛[CCl3CH(OH)2],配 制后在2d~14d内使用。 6 仪器和设备 6.1 天平:感量0.1mg。 6.2 解剖工具。 6.3 试管:10mL具塞刻度试管。 6.4 表面皿或培养皿。 6.5 注射器及针头。 6.6 可调移液器及枪头。 6.7 显微镜(带显微摄影)。 6.8 游标卡尺:精度0.01mm。 2GB/T32757—2016 6.9 离心机:3000×g~6000×g。 7 染色体标本的制备 7.1 实验材料的选择 按不同方法选择胚胎、担轮幼虫或鳃组织。 7.2 预处理 7.2.1 胚胎法 将胚胎放入含秋水仙素的水中处理,秋水仙素浓度和处理时间因种类而不同,一般秋水仙素浓度 10mg/L~50mg/L,处理时间20min~40min。 7.2.2 担轮幼虫法 将担轮幼虫放入含秋水仙素的水中处理,秋水仙素浓度和处理时间因种类而不同,一般秋水仙素浓 度10mg/L~100mg/L,处理时间1h~2.5h。 7.2.3 成体鳃组织法 剪取部分鳃组织放入含秋水仙素的水中处理,秋水仙素浓度100mg/L~400mg/L,处理时间 30min~2h。 7.2.4 整贝 7.2.4.1 秋水仙素预处理 可分为以下两种方法: a) 秋水仙素肌肉注射后暂养一段时间,注射剂量为2μg/g体重~8μg/g体重,暂养时间3h~ 15h; b) 对个体较小、不便于注射的贝类,可放置在含有秋水仙素浓度为0.1g/L~1g/L的水中暂养 4h~12h。 7.2.4.2 PHA+秋水仙素预处理 可分为以下两种方法: a) 按5μg/g体重~8μg/g体重肌肉注射PHA,暂养16h~24h后,按2μg/g~8μg/g体重注 射秋水仙素,暂养3h~6h;还可以在第一次注射PHA后18h~20h,同剂量重复注射1次, 暂养5h~6h后再注射秋水仙素。 b) 先将贝放入添加100μg/mLPHA的水中暂养16h~24h,再放入含50μg/mL秋水仙素的水 中暂养4h~6h。 7.3 低渗 可以采用以下方法之一进行低渗处理: a) 75mol/L的KCl低渗,处理时间因种类不同,从10min~2h不等; b) 用25%海水低渗,处理时间30min~50min。 低渗前可采用胰蛋白酶消化、剪碎等方法提高低渗效果。GB/T32757—2016 GB/T32757—2016 7.4 固定 1000×g离心10min,弃上清,加入新配制的卡诺氏固定液,用吸管吹打至细胞散开,冰浴固定 30min;重复3次~5次。 7.5 解离 固定液替换为50%冰乙酸对固定样品进行细胞的解离,也可在固定液中用吸管轻轻吹打至细胞散 开。用冰乙酸进行解离时需要换回卡诺氏固定液保存。 7.6 制片 7.6.1 压片法 将解离后的样品置于清洗干净的载玻片上,滴上适量染色液染色后压片。此法适合于用组织块进 行染色体的制备。染色方法可选用以下方法之一。 a) 2%醋酸洋红染色20min; b) 卡宝品红改良液染色5min; c) 醋酸地衣红染色30min~1h; d) 醋酸铁苏木精水合氯醛染色液染色12h~24h。 7.6.2 滴片法 将细胞悬液摇匀,待大颗粒下沉后,取上层悬液,加入新鲜配制的固定液,用吸管吹打均匀。吸取细 胞悬液在约45°倾斜的玻片上滴2滴~3滴(玻片可预热至50℃~60℃或冷冻),并轻轻吹动使细胞铺 散开,空气干燥法干燥后用4%~20%的吉姆萨液染色5min~30min,用清水冲洗干净后晾干。 7.6.3 封片 二甲苯透明,中性树胶封片,干燥后镜检。 8 组型分析方法 按GB/T18654.12的规定执行。 9 其他形态特征的观察 除计数和分组外,还应观察染色体的其他形态特征,如有无异形染色体,次缢痕,随体等,并计入 结果。