ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T32766—2016 最大拟长针线虫检疫鉴定方法 DetectionandidentificationofParalongidorusmaximus(Bütschli,1874) Siddiqi,1964 2016-06-14发布 2017-01-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中国检验检疫科学院、深圳出入境检验检疫局、中国农业科学研究院植物保护研 究所、上海出入境检验检疫局、南通出入境检验检疫局、天津出入境检验检疫局。 本标准主要起草人:葛建军、王旭、熊玉芬、李芳荣、彭德良、戚龙君、张明、龙海、王金成。 ⅠGB/T32766—2016 最大拟长针线虫检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了最大拟长针线虫的检疫鉴定方法。 本标准适用于观赏植物、蔬菜、果树等多种植物、土壤及栽培介质中最大拟长针线虫的检疫和鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T24831—2009 香蕉穿孔线虫检疫鉴定方法 SN/T2122—2008 进出境植物及植物产品检疫抽样 3 最大拟长针线虫基本信息 学名:Paralongidorusmaximus(Bütschli,1874)Siddiqi,1964。 异名:DorylaimusmaximusBütschli,1874;Dorylaimus(Longidorus)maximus(Bütschli,1874) Micoletzky,1922;Longidorusmaximus(Bütschli,1874)Thorne&Swanger,1936;Longidorusmaxi- musMeyl,1954;LongidorusmeyliSturhan,1963;最大异长针线虫。 分类地位:线虫门Nematoda,无侧尾腺纲Adenophorea,矛线目Dorylaimida,矛线亚目Dorylaimina,长 针总科Dorylaimoidea,长针科Longidoridae,长针亚科Longidorinae,拟长针属Paralongidorus。 4 方法原理 最大拟长针线虫成虫的形态学特征、寄主范围和地理分布(参见附录A)作为主要的鉴定依据。 5 器材和试剂 5.1 器材 生物显微镜、体视显微镜(具透射光源)、加热板、水浴锅、离心机。自封袋、钟面皿或培养皿、载玻 片、盖玻片、网筛(20目、100目、500目)、烧杯(500mL、1000mL)、漏斗、漏斗架、乳胶管或硅胶管、止 水夹、小镊子、剪刀、挑针、浅盘、滤纸或卫生纸、酒精灯、干燥器和试管等。 5.2 试剂 4%甲醛、指甲油、甘油、无水乙醇、冰醋酸、石蜡和蔗糖等。 6 现场检疫 将其主要寄主植物(参见附录A)作为现场检疫最重要的对象。注意观察植株的生长状况、根部为 1GB/T32766—2016 害状,以及根际是否带土壤或栽培介质。重点选择上述可疑植物材料及土壤或栽培介质取样。如无可 疑症状则按要求随机取样。 具体抽样方法详见SN/T2122—2008中5.5。 7 实验室检测鉴定 7.1 线虫分离 植物栽培介质或少量的土壤样品,采用直接过筛法或悬浮过滤法分离线虫;大量的土壤样品,采用 蔗糖离心法分离线虫。 具体分离方法参见附录B。 7.2 体视显微镜镜检 在体视显微镜下观察分离获得的线虫样品。最大拟长针线虫的虫体较大,呈长蠕虫形,行动较为缓 慢。挑取线虫若干条制成临时玻片或永久玻片在生物显微镜下观察线虫形态。 具体玻片标本制作方法参见GB/T24831—2009中附录C。 7.3 生物显微镜镜检和测计 对照最大拟长针线虫雌、雄虫的主要鉴定特征进行重点观察、拍摄、测量和计算。在线虫样品数量 充足时,应观察雌、雄虫各20条以上。 8 形态鉴定特征 8.1 拟长针线虫属形态鉴定特征 8.1.1 雌虫 线虫虫体大,头部连续,缢缩显著;侧器口横裂状,侧器囊漏斗状至倒马镫状;齿尖针细长,有时高度 硬化,基部平滑或呈叉状;齿托基部无凸缘,有时明显增厚;齿针导环为单环,位于齿尖针前半部;双生殖 腺,对伸回折,子宫无骨化结构;尾短,呈半球形或圆锥形。 8.1.2 雄虫 双生殖腺,对伸;交合刺粗壮、有侧附导片;泄殖腔区有1对交配乳突,其前紧接着有1列腹中交配 乳突。 8.2 最大拟长针线虫形态鉴定特征 8.2.1 测计值 最大拟长针线虫的测计值见表1。 表1 最大拟长针线虫测计值(Sturhan,1963) 测计项目 雌虫 雄虫 n 46~83 2 L/mm 9.84(7.60~12.35) 8.55,10.70 2GB/T32766—2016 表1(续) 测计项目 雌虫 雄虫 a 107(77~133) 97,110 b 15.6(12.8~23.7) 12.9,14.1 c 250(178~320) 190,237 V 38.3(36.1~40.4) — ODS/μm 171.5(152~187) 171,173 ODP/μm 53.5(42~70) 52.5,56 OGR/μm 41(37~47) 39.5,43 注:n———测量的线虫标本数目;L———虫体体长;a———体长/最大体宽;b———体长/虫体前端至食道与肠连接处 的距离;c———体长/尾长;V———虫体前端至阴门的距离×100/体长;ODS———齿尖针长度;ODP———齿托长 度;OGR———导环至头端的距离。 8.2.2 形态特征描述 8.2.2.1 雌虫 虫体大,长7mm~12mm,热杀死后虫体呈开螺旋形,虫体后半部弯曲;头与身体连接处的前部分 表皮厚度为7μm~10μm,体中部表皮厚度为4μm~7μm,尾末端表皮厚度为10μm~18μm;头部 圆,宽度为35μm~39μm,高度小于宽度的一半。侧面观时,头部膨大,在接近侧器孔后部位置处深度 缢缩;腹面观时,侧器孔处轻度缢缩,并有向后的浅度凹陷;唇区通常有6个内环乳突和10个外环乳突; 侧器倒马镫状,宽封状开口达唇区宽的2/3;齿针全长220μm~263μm;齿尖针长152μm~187μm,齿 尖针基部宽3μm;齿托长42μm~71μm;基部无凸缘;导环距头端36μm~47μm,宽7μm~9μm;神 经环距头端224μm~284μm,位于食道腺中部稍靠后的位置;半月体长5μm~7μm,与神经环位置水 平,距头端232μm~288μm;食道腺前部细,弯曲呈环状与食道腺基部重叠。食道腺基部长143μm~ 163μm,宽25μm~35μm。背食道腺核位于背食道腺开口后一段距离,第一对亚腹食道腺核位于食道 腺中部附近,第二对亚腹食道腺核位于食道腺基部,不明显。食道与肠间瓣门钝凸锥形,长36μm,但有 时不明显;阴门横裂,裂缝长度约为阴门处体宽的1/4;双生殖腺、对生、等长、回折;直肠前区可变,长度 为肛门处体宽的4倍~17倍;直肠长度约几乎为肛门处体宽一半;尾短,钝圆,长26μm~38μm,约是 肛门处体宽的一半(c'=0.44~0.60)。具2对或3对尾乳突。一对在亚腹面,另一对在亚背面或侧面。 8.2.2.2 雄虫 极为少见。 体前端与雌虫相似,后端向腹面弯曲程度较大;交合刺强壮,长100μm~106μm;侧附导片长 32μm~35μm,具有指状的末端;有1对泄殖腔区交配乳突和14个~15个泄殖腔前腹面交配乳突。 8.2.2.3 形态特征图 最大拟长针线虫形态鉴定特征图参见附录C。 8.2.2.4 与近似种的区别 鉴定过程中应注意该线虫与其近似种拟最大拟长针线虫的形态区别,详见附录D。 3GB/T32766—2016 9 结果判定 符合第8章形态鉴定特征以及测计值的可判定为最大拟长针线虫。 10 样品和资料保存 10.1 样品保存与处理 样品经登记和经手人签字后妥善保存。对已鉴定出最大拟长针线虫的样品应置于密封塑料袋中保 存于4℃冰箱,至少保存3个月,以备复核、谈判和仲裁。 10.2 线虫保存与处理 从检测样品中分离并鉴定为最大拟长针线虫的线虫材料,应妥善保存。将剩余的线虫杀死、固定后 制成永久玻片标本保存,也可用4%甲醛固定后长期保存。标本标签中应尽量写明样品编号、种名、制 作时间、制作人、寄主、产地等信息。 10.3 资料保存与处理 完整的原始实验记录包括样品的来源、种类、时间,实验的时间、地点、方法和结果等。检测报告要 有实验人员和审核人员签字。全部资料归档,妥善保管,以备复核、谈判和仲裁。 4GB/T32766—2016 附 录 A (资料性附录) 最大拟长针线虫其他信息 A.1 寄主植物 最大拟长针线虫主要的寄主植物包括菜豆Phaseolusvulgaris、草莓Fragariaananassa、大丽花 Dahliapinnata、鹅耳枥属Carpinus、胡萝卜Daucuscarotavar.sativa、花椰菜Brassicaoleraceavar. botrytis、黄瓜Cucumissativus、韭葱Alliumporrum、菊花Chrysanthemumsinense、菊科Compositae、 冷杉属Abies、栎属Quercus、落叶松属Larix、马铃薯Solanumtuberosum、玫瑰Solanumtuberosum、桤 木属Al