书 书 书犐犆犛 ６７ ． ０４０ 犡 ０４ 　 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 ９６９５ ． ３２ — ２００９ 肉与肉制品 　 氯霉素含量的测定 犕犲犪狋犪狀犱犿犲犪狋狆狉狅犱狌犮狋狊 — 犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犮犺犾狅狉犪犿狆犺犲狀犻犮狅犾犮狅狀狋犲狀狋 ２００９  ０４  ０８ 发布 ２００９  ０５  ０１ 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本标准制定过程中参考了 “ 欧盟食品分析方法 ＣＹ３．６ ”。 本标准的附录 Ａ 为资料性附录 。 本标准由全国肉禽蛋制品标准化技术委员会提出并归口 。 本标准起草单位 ： 中国肉类食品综合研究中心 、 中国商业联合会商业标准中心 、 武汉市疾病预防控 制中心 、 江阴市产品质量监督所 、 厦门市疾病预防控制中心 。 本标准主要起草人 ： 宋永青 、 赵榕 、 梁高道 、 郭文萍 、 吴东雷 、 骆和东 、 靳晓蕾 、 刘振宇 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ９６９５ ． ３２ — ２００９ 肉与肉制品 　 氯霉素含量的测定 １ 　 范围 本标准规定了畜禽肉中氯霉素的测定方法 。 本标准适用于畜禽肉中氯霉素的测定 。 本标准检出限 ： 气相色谱  质谱法 ， 检出限为 ０．２ μ ｇ ／ ｋｇ ； 酶联免疫法为 ０．０５ μ ｇ ／ ｋｇ 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件中的条款通过 ＧＢ ／ Ｔ９６９５ 本部分的引用而成为本部分的条款 。 凡是注日期的引用文件 ， 其随后所有的修改单 （ 不包括勘误的内容 ） 或修订版均不适用于本部分 ， 然而 ， 鼓励根据本部分达成协议 的各方研究是否可使用这些文件的最新版本 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本适用于本部分 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 （ ＧＢ ／ Ｔ６６８２ — ２００８ ， ＩＳＯ３６９６ ： １９８７ ， ＭＯＤ ） ＧＢ ／ Ｔ９６９５．１９ 　 肉与肉制品 　 取样方法 ３ 　 气相色谱  质谱法 （ 确证法 ） ３ ． １ 　 原理 样品中氯霉素用乙酸乙酯提取 ， 脂肪用正己烷去除 ， 经 Ｃ １８ 净化 ， ＢＳＴＦＡ＋ＴＭＣＳ （ ９９＋１ ） 衍生后 ， 用 ＮＣＩ 源选择 犿 ／ 狕 为 ４６６ 的特征离子为目标离子 ， 在 ＳＩＭ 模式下进行 ＧＣＭＳ 测定 。 ３ ． ２ 　 试剂和材料 若无特别说明 ， 所用试剂均为分析纯 ， 所用水应符合 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 的要求 。 ３ ． ２ ． １ 　 氯霉素 ： 标准品 ， 纯度 ≥ ９９％ 。 ３ ． ２ ． ２ 　 甲醇 ： 色谱纯 。 ３ ． ２ ． ３ 　 三氯甲烷 。 ３ ． ２ ． ４ 　 正己烷 ： 色谱纯 。 ３ ． ２ ． ５ 　 乙酸乙酯 。 ３ ． ２ ． ６ 　 无水硫酸钠 。 ３ ． ２ ． ７ 　 氯化钠 。 ３ ． ２ ． ８ 　 Ｎ 、 Ｏ 双三甲基硅烷三氟乙酰胺 （ ＢＳＴＦＡ ）。 ３ ． ２ ． ９ 　 三甲基氯硅烷 （ ＴＭＣＳ ）。 ３ ． ２ ． １０ 　 丙酮 ： 色谱纯 。 ３ ． ２ ． １１ 　 甲苯 。 ３ ． ２ ． １２ 　 甲醇溶液 ： 甲醇 ＋ 水 ＝２＋８ 。 ３ ． ２ ． １３ 　 氯化钠溶液 （ ４０ｇ ／ Ｌ ）： 称取 ４．００ｇ 氯化钠 （ ３．２．７．７ ）， 用水溶解 ， 定容至 １００ｍＬ 。 ３ ． ２ ． １４ 　 甲醇  氯化钠溶液 ： 量取甲醇溶液 （ ３．２．１２ ） ２０ｍＬ 、 氯化钠溶液 （ ３．２．１３ ） ８０ｍＬ ， 混匀 。 ３ ． ２ ． １５ 　 混合衍生剂 ： Ｎ 、 Ｏ 双三甲基硅烷三氟乙酰胺 ＋ 三甲基氯硅烷 ＝９９＋１ 。 ３ ． ２ ． １６ 　 氯霉素标准储备溶液 （ 犮 ＝０．１ｍｇ ／ ｍＬ ）： 称取氯霉素标准品 ０．０１ｇ （ 精确至 ０．０００１ｇ ）， 用丙酮 溶解并定容至 １００ｍＬ 。 储备液贮存在 ４℃ 冰箱中 ， 可使用两个月 。 ３ ． ２ ． １７ 　 氯霉素标准工作溶液 ： 根据试验需要 ， 用丙酮 （ ２．２．１０ ） 稀释标准储备溶液 （ ２．２．１７ ）， 配成适当 浓度的标准工作溶液 。 １ 犌犅 ／ 犜 ９６９５ ． ３２ — ２００９ ３ ． ３ 　 仪器设备 实验室常规设备及下列仪器 。 ３ ． ３ ． １ 　 气相色谱  质谱联用仪 （ ＧＣＭＳ ）。 ３ ． ３ ． ２ 　 分析天平 ： 可准确称重至 ０．０００１ｇ 。 ３ ． ３ ． ３ 　 分析天平 ： 可准确称重至 ０．０１ｇ 。 ３ ． ３ ． ４ 　 离心机 ： ５５００ｒ ／ ｍｉｎ 。 ３ ． ３ ． ５ 　 涡旋仪 。 ３ ． ３ ． ６ 　 固相萃取装置 。 ３ ． ３ ． ７ 　 旋转蒸发仪 。 ３ ． ３ ． ８ 　 均质器 。 ３ ． ３ ． ９ 　 振荡器 。 ３ ． ３ ． １０ 　 机械设备 ： 用于试样的均质 。 包括 ： 绞肉机 、 斩拌机等肉类组织粉碎机 。 ３ ． ３ ． １１ 　 氮吹仪 。 ３ ． ３ ． １２ 　 具塞离心管 ： ５０ｍＬ 、 １０ｍＬ 。 ３ ． ３ ． １３ 　 Ｃ １８ 固相萃取柱或相当者 ： ２００ｍｇ ， ３ｍＬ 。 ３ ． ４ 　 分析步骤 ３ ． ４ ． １ 　 试样液制备 ３ ． ４ ． １ ． １ 　 试样的制备 按 ＧＢ ／ Ｔ９６９５．１９ 规定的方法取样 。 至少取有代表性的试样 ２００ｇ ， 使用适当的机械设备 （ ３．３．１０ ） 将试样均质 。 均质后的试样尽快分析 ， 否则 ， 应密封低温贮存 ， 防止试样变质或成分发生变化 。 贮存的 试样在启用时 ， 应重新混匀 。 ３ ． ４ ． １ ． ２ 　 提取 称取 １０ｇ 样品 （ 精确至 ０．０１ｇ ） 置于 ５０ｍＬ 具塞离心管中 ， 加入少量无水硫酸钠和 ３０ｍＬ 乙酸乙 酯均质 １ｍｉｎ ， 以 ５０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ５ｍｉｎ 后 ， 用吸管吸出上层乙酸乙酯于浓缩瓶中 ， 残渣再加入乙酸乙 酯 １５ｍＬ 重复提取样品 ， 合并提取液 。 提取液在 ５０℃ 水浴中旋转蒸发 ， 除去乙酸乙酯 ， 加入 １ｍＬ 甲 醇  氯化钠溶液 （ ３．２．１４ ） 和 ４ｍＬ 正己烷 ， 充分振摇后 ， 转移至 １０ｍＬ 具塞离心管中 ， 用 １ｍＬ 甲醇  氯化 钠溶液 （ ３．２．１４ ） 清洗浓缩瓶 ， 合并清洗液于 １０ｍＬ 具塞离心管中 。 涡旋 ０．５ｍｉｎ ， 经 ３０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ３ｍｉｎ 后 ， 用吸管吸去正己烷 ， 加入 ４ｍＬ 正己烷重复上述操作 。 然后在离心管中加入 ４ｍＬ 乙酸乙酯 ， 涡旋 １ｍｉｎ ， 经 ３０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ３ｍｉｎ 后 ， 用吸管吸出乙酸乙酯 ， 加入 ４ｍＬ 乙酸乙酯重复上述操作 ， 合 并乙酸乙酯于浓缩瓶中 ， 在 ５０℃ 水浴中旋转浓缩至近干 ， 用 ５ｍＬ 水溶解残渣 。 ３ ． ４ ． １ ． ３ 　 净化 依次用 ５ｍＬ 甲醇 、 ５ｍＬ 三氯甲烷 、 ５ｍＬ 甲醇 、 ５ｍＬ 水活化 Ｃ １８ 固相萃取柱 （ ３．３．１４ ）， 然后加入上 述步骤得到的提取液 ， 加 ５ｍＬ 甲醇 ＋ 水 （ ３．２．１２ ） 淋洗色谱柱 ， 用 ２５ｍＬ 甲醇洗脱于浓缩瓶中 ， 洗脱液 在 ５０℃ 下浓缩至近干 。 用 １００ μ Ｌ 甲醇溶解残渣 ， 并转移至 １０ｍＬ 具塞离心管中 ， 再用甲醇冲洗浓缩 瓶 ， 合并洗液 ， 于 ５０℃ 下用氮气吹干 。 ３ ． ４ ． １ ． ４ 　 衍生化 于吹干的试样残渣中加入 １００ μ Ｌ 甲苯和 １００ μ Ｌ 混合衍生剂 （ ３．２．１５ ）， 盖紧塞后 ， 涡旋混匀 １ｍｉｎ ， ６０℃ 下反应 ３０ｍｉｎ ， 然后在 ５０℃ 下用氮气吹干 ， 加入 １ｍＬ 正己烷溶解残渣 。 ３ ． ４ ． ２ 　 标准工作液制备 配制好的标准工作液按 ３．４．１．４ 步骤进行操作 。 ３ ． ４ ． ３ 　 空白液制备 除不称取试样外 ， 均按 ３．４．１ 步骤进行操作 。 ２ 犌犅 ／ 犜 ９６９５ ． ３２ — ２００９ ３ ． ４ ． ４ 　 测定 ３ ． ４ ． ４ ． １ 　 气相色谱  质谱法测定条件 色谱柱 ： ＤＢ５ＭＳ （ ３０ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５ μ ｍ ） 石英毛细管柱或相当者 ； 载气 ： 氦气 ， 纯度 ≥ ９９．９９９％ ； 流速 ： １．６５ｍＬ ／ ｍｉｎ ； 进样口温度 ： ２５０℃ ； 进样量 ： １ μ Ｌ ； 进样方式 ： 无分流 （ 保持 １ｍｉｎ ） 进样 ； 柱温程序 ： 初始 ５５℃ ， 保持 １ｍｉｎ ， 以 ２５℃ ／ ｍｉｎ 速度升至 ２８０℃ ， 保持 ６ｍｉｎ ； ＮＣＩ 源 ： ７０ｅＶ ； 离子源温度 ： １５０℃ ； 接口温度 ： ２８０℃ ； 溶剂延迟 ： ７ｍｉｎ ； 反应气 ： 甲烷 ， 纯度 ≥ ９９．９９％ ； 选择离子检测 ： 保留时间 ／ ｍｉｎ 　　 目标物 　　 检测离子 犿 ／ 狕 １２．５８ 　　 ＣＡＰＴＭＳ 　　 ４６６ ， ４６８ ， ３７６ ， ３７８ ３ ． ４ ． ４ ． ２ 　 定性测定 　　 进行样品测定时 ， 如果检出的色谱峰保留时间与标准样品相一致 ， 并且在扣除背景后的样品质谱图 中 ， 所选择的离子均出现 ， 而且所选择的离子比与标准样品衍生物