书 书 书犐犆犛 ６５ ． １５０ 犅 ５１ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 ２１４４３ — ２００８ 海 　 湾 　 扇 　 贝 犅犪狔狊犮犪犾犾狅狆 ２００８  ０２  １５ 发布 ２００８  ０５  ０１ 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本标准的附录 Ａ 、 附录 Ｂ 、 附录 Ｃ 为规范性附录 。 本标准由中华人民共和国农业部提出 。 本标准由全国水产标准化技术委员会海水养殖分技术委员会归口 。 本标准起草单位 ： 中国科学院海洋研究所 。 本标准主要起草人 ： 刘保忠 、 张国范 、 董波 、 阙华勇 、 尤锋 、 张晓军 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ２１４４３ — ２００８ 海 　 湾 　 扇 　 贝 １ 　 范围 本标准给出了海湾扇贝 （ 犃狉犵狅狆犲犮狋犲狀犻狉狉犪犱犻犪狀狊 Ｌａｍａｒｃｋ ） 主要形态构造特征 、 生长与繁殖习性 、 遗 传学特征以及检测方法 。 本标准适用于海湾扇贝的种质监测和鉴定 。 ２ 　 名称与分类 ２ ． １ 　 学名 海湾扇贝 犃狉犵狅狆犲犮狋犲狀犻狉狉犪犱犻犪狀狊 Ｌａｍａｒｃｋ 。 ２ ． ２ 　 分类位置 软体动物门 （ Ｍｏｌｌｕｓｃａ ）， 瓣鳃纲 （ Ｌａｍｅｌｌｉｂｒａｎｃｈｉａ ）， 珍珠贝目 （ Ｐｔｅｒｉｏｉｄａ ）， 扇贝科 （ Ｐｅｃｔｉｎｉｄａｅ ）， 海 湾扇贝属 （ 犃狉犵狅狆犲犮狋犲狀 ）。 ３ 　 主要生物学性状 ３ ． １ 　 外部形态特征 ３ ． １ ． １ 　 外形 贝壳扇形 ， 两壳几乎相等 ， 右壳稍高 ， 后耳大于前耳 。 前耳下方生有足丝孔 ， 成体无足丝 ， 绞合部相 连且平直 ， 肋较宽而高起 ， 肋上无棘 。 生长纹较明显 。 壳面有放射肋 １７ 条 ～ １８ 条 ， 壳面呈黑褐色 、 褐 色 、 黄色或灰白色 。 成贝壳高 ６ｃｍ 左右 。 海湾扇贝的外部形态见图 １ 。 图 １ 　 海湾扇贝外部形态 ３ ． １ ． ２ 　 可数性状 壳面有放射肋 １７ 条 ～ １８ 条 。 ３ ． １ ． ３ 　 可量性状 对于壳长 ４９．４０ｍｍ ～ ６８．７０ｍｍ ， 体重 １６．４３ｇ ～ ３６．５２ｇ 的 ５５ 个成体进行数量性状的测量 ， 统计 数据见表 １ 。 １ 犌犅 ／ 犜 ２１４４３ — ２００８ 表 １ 　 海湾扇贝数量性状统计值 性状 壳长 犔 ／ ｍｍ 壳宽 ／ ｍｍ 壳高 犎 ／ ｍｍ 体重 犠 ／ ｇ 平均值 ５５．９３ ２３．６７ ５３．８２ ２５．３７ 标准差 ±４．４１ ±２．０７ ±３．８６ ±５．２３ ３ ． １ ． ４ 　 体重 、 壳长生长关系式 海湾扇贝在自然条件下体长与体重关系见式 （ １ ）： 犠 ＝ ０ ． ００３２ × 犔 ２ ． ２２４４ …………………………（ １ ） 　　 式中 ： 犠 ——— 海湾扇贝体长 犔 时的体重 ， 单位为克 （ ｇ ）； 犔 ——— 海湾扇贝体重 犠 时的壳长 ， 单位为毫米 （ ｍｍ ）。 ３ ． ２ 　 内部构造特征 ３ ． ２ ． １ 　 外套膜 简单型外套膜 ， 具外套眼和外套触手 。 ３ ． ２ ． ２ 　 生殖系统 雌雄同体 ， 精巢位于腹嵴外周缘 ， 卵巢位于精巢内侧 。 ４ 　 生长与繁殖特征 ４ ． １ 　 生长 在适宜生长条件下 ， ８ 个月平均壳长可达 ５ｃｍ ， 寿命 １２ 个月 ～ １６ 个月 。 ４ ． ２ 　 繁殖习性 一年有春秋两次繁殖期 。 黄渤海区春季繁殖期在 ５ 月下旬至 ６ 月 ， 秋季为 ９ 月至 １０ 月 。 海湾扇贝繁殖力强 ， 一只壳长 ５ｃｍ 以上的成贝一次产卵量为 ５０×１０ ４ 粒 ～ ６０×１０ ４ 粒 ， 一个产卵 期产卵量 １５０×１０ ４ 粒 ～ ２００×１０ ４ 粒 。 ５ 　 细胞遗传学特征 体细胞染色体 ２ 倍数 ： ２ 狀 ＝３２ ， 核型表达式 ： ２ 狀 ＝２ｓｍ＋１２ｓｔ＋１８ｔ ， ＮＦ＝３４ 。 即亚中部着丝粒染色体 （ ｓｍ 组 ） １ 对 ， 亚端部着丝粒染色体 （ ｓｔ 组 ） ６ 对 ， 端部着丝粒染色体 （ ｔ 组 ） ９ 对 ， 染色体臂数 （ ＮＦ ） ３４ ， 见图 ２ 。 图 ２ 　 海湾扇贝染色体核型 ６ 　 生化遗传学特征 肌肉中苹果酸脱氢酶 （ ＭＤＨ ） 同工酶为单态 ， 酶谱见图 ３ 。 ２ 犌犅 ／ 犜 ２１４４３ — ２００８ 图 ３ 　 苹果酸脱氢酶 （ 犕犇犎 ） 酶谱 ７ 　 分子遗传学特征 １６ＳｒＤＮＡ 序列 （ ５４７ｂｐ ）： ５ ’— ３ ’ ＣＧＣＣＴＧＴＴＴＡＴＣＡＡＡＡＡＣＡＴＧＧＣＴＣＣＣＴＴＧＡＡＴＡＡＣＣＡＴＡＡＧＧＡＧＴＣＧＧＴ ＧＣＣＴＴＣＣＣＧＧＴＧＡＧＴＴＴＡＡＡＣＴＴＡＡＡＣＧＧＡＴＧＣＧＧＴＡＡＡＧＣＧＴＧＣＴＡＡＧＧ ＴＡＧＣＴＴＡＡＧＴＴＡＴＧＧＣＣＴＡＧＴＴＡＡＴＴＧＴＡＧＧＣＣＣＴＧＴＧＡＡＴＧＧＴＴＴＧＡＣＧ ＡＧＴＴＴＴＣＴＴＣＴＧＴＣＴＣＴＡＧＣＴＴＧＴＴＴＡＡＧＴＧＡＡＣＴＴＧＡＧＴＴＧＧＡＴＧＴＧＣＡ ＡＡＴＧＣＴＴＣＣＴＴＧＧＴＡＡＡＧＡＡＡＧＡＣＧＡＧＡＡＧＡＣＣＣＣＧＴＧＡＧＧＴＴＡＧＡＡＡＴＴ ＡＡＴＧＴＧＣＡＧＡＡＴＡＧＴＧＧＧＡＧＧＣＴＡＣＴＴＴＴＴＣＴＧＣＣＴＴＡＴＡＧＴＴＴＴＧＧＣＴＧ ＧＧＧＣＡＧＣＡＡＧＧＧＧＧＣＡＡＡＡＧＴＡＧＡＣＣＣＣＴＴＡＡＡＡＴＴＴＡＡＴＴＣＴＧＧＴＧＡＧＴ ＡＡＴＧＡＣＣＣＡＴＡＡＧＧＴＴＴＡＡＧＧＧＴＡＴＧＡＴＴＡＧＴＡＧＡＡＧＡＡＧＴＴＡＣＴＣＣＧＧＧ ＧＡＴＡＡＣＡＧＣＧＴＡＡＴＣＣＧＣＣＴＴＧＡＣＡＧＴＣＣＴＴＡＴＡＧＡＴＧＧＧＴＧＧＧＴＴＴＧＣＧ ＡＣＣＴＣＧＡＴＧＴＴＧＧＣＴＣＴＧＧＡＴＧＴＣＣＴＧＡＡＧＣＴＧＴＡＧＧＣＧＧＴＴＴＣＡＡＧＧＧＴ ＴＧＧＴＴＣＧＴＴＣＧＣＣＣＡＴＴＡＡＡＡＴＣＣＡＡＣＧＴＧＡＴＣＴＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＣＧＧ ８ 　 检测方法 ８ ． １ 　 染色体和核型检测 ８ ． １ ． １ 　 染色体标本的制备 ａ ） 　 剪取活体扇贝鳃组织 ， 置于 ０．０４％ 秋水仙素溶液中处理 １５ｍｉｎ ～ ４０ｍｉｎ ； ｂ ） 　 从秋水仙素溶液中取出后 ， 置于 ２５％ 低渗海水中处理 ４０ｍｉｎ ～ ５０ｍｉｎ ； ｃ ） 　 从低渗海水中取出后 ， 置于 Ｃａｒｎｏｙｓ 固定液中固定 ４ 次 ， 每次 １５ｍｉｎ ； ｄ ） 　 固定完毕后 ， 置于 ０℃ ～ ４℃ 冰箱中过夜 ； ｅ ） 　 从冰箱中取出 ， 在距玻片 ２０ｃｍ ～ ３０ｃｍ 处滴下 ， 玻片温度 ５６℃ ～ ６０℃ ； ｆ ） 　 １０％Ｇｉｅｍｓａ 染液染色 １０ｍｉｎ ～ ２０ｍｉｎ （ Ｇｉｅｍｓａ 染液配制见附录 Ａ ）； ｇ ） 　 流水冲洗 ， 显微镜下观察 。 ８ ． １ ． ２ 　 染色体计数 在显微镜下观察 ， 计数 １００ 个以上清晰 、 分散良好的中期分裂相 ， 测定染色体数目 ， 统计得出二倍体 染色体条数 。 ８ ． １ ． ３ 　 核型分析 选取 ７ 套 ～ １０ 套染色体分裂相进行拍照 、 放大 ， 测量染色体及其长臂 、 短臂的长度 ， 计算其相对长 度 、 臂比 、 臂指数 、 着丝粒指数 。 根据二倍体染色体相对长度 、 臂比 、 着丝粒指数 ， 参照 Ｌｅｖａｎ 的分类标 准 ， 得出二倍体的染色体核型公式 。 ８ ． ２ 　 同工酶分析 ８ ． ２ ． １ 　 样品制备 样本活体 ， 解剖取其闭壳肌 ０．１ｇ ～ ０．２ｇ ， 加 ２ 倍体积的 ＴｒｉｓＨＣｌ 缓冲液 （ ０．０１ｍｏｌ ／ Ｌ ， ｐＨ＝７．０ ）， 并 ３ 犌犅 ／ 犜 ２１４４３ — ２００８ 加适量处理过的石英砂冰上匀浆 ， 然后在 ４℃ ， １２０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ２０ｍｉｎ ， 取上清液分装后用于电泳 。 ８ ． ２ ． ２ 　 电泳方法 采用淀粉凝胶 ＴＣ 缓冲系统 Ｔｒｉｓ 柠檬酸 ， ｐＨ＝６．９ 进行电泳分析 。 凝胶浓度为 １３％ （ 质量分数 ）， 胶制好后 ， 样品加在靠阴极一侧 ， 用滤纸蘸样品液插入孔中 。 电泳在 ４℃ 冰箱内进行 ， 电压 １２０Ｖ ， 电流 ２２ｍＡ ／ 板 （ ＴＣ ）。 电泳结束后进行染色 ， 染色液配方见附录 Ｂ 。 ８ ． ３ 　 犇犖犃 特征标记分析 ８ ． ３ ． １ 　 犇犖犃 的提取 取闭壳肌 ３００ｍｇ 剪碎后 ， 放入 ６００ μ Ｌ 裂解液 ， ５５℃ 水浴消化至组织碎块完全裂解 。 裂解液分别用 等体积的饱和酚 、 酚 ∶ 三氯甲烷 （ １∶１ ）、 三氯甲烷 ∶ 异戊醇 （ ２４∶１ ） 抽提 ， 加入 ２ 倍体积的无水乙醇和终 浓度 １０％ 的乙酸钠离心沉淀 ＤＮＡ ， 最后用 ７０％ 的乙醇洗 ２ 次后晾干 。 裂解液配方见附录 Ｃ 。 ８ ． ３ ． ２ 　 片段克隆和纯化 以提取的 ＤＮＡ 为模板 ， 利用两个特异性引物进行 ＰＣＲ 扩增 。 ８ ． ３ ． ２ ． １ 　 引物序列 ｆ ： ５ ’ ＣＧＣＣＴＧＴＴＴＡＴＣＡＡＡＡＡＣＡＴ３ ’ ｒ ； ５ ’ ＣＣＧＧＴＣＴＧＡＡＣＴＣＡＧＡＴＣＡＣＧＴ３ ’ ８ ． ３ ． ２ ． ２ 　 反应条件 ９４℃ 变性 ２ｍｉｎ ， １ 个循环 ； ９４℃ 变性 ３０ｓ ， ５５℃ 退火 １ｍｉｎ ， ７２℃ 延伸 １ｍｉｎ ， ３５ 个循环 ； ７２℃ 延伸 １０ｍｉｎ ， １ 个循环 。 反应液配方见附录 Ｃ 。