书 书 书犐犆犛 １１ ． ２２０ 犅 ４１ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 ２１６７４ — ２００８ 猪圆环病毒聚合酶链反应试验方法 犇犲狋犲犮狋犻狀犵狆狅狉犮犻狀犲犮犻狉犮狅狏犻狉狌狊狑犻狋犺狆狅犾狔犿犲狉犪狊犲犮犺犪犻狀狉犲犪犮狋犻狅狀 ２００８  ０４  ０９ 发布 ２００８  ０６  ０１ 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本标准附录 Ａ 为规范性附录 。 本标准由中华人民共和国农业部提出 。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口 。 本标准起草单位 ： 农业部兽医诊断中心 。 本标准主要起草人 ： 田克恭 、 王宏伟 、 孙明 、 王传彬 、 陈西钊 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ２１６７４ — ２００８ 引 　　 言 　　 猪圆环病毒依据其致病性和基因组差异分为无致病性的猪圆环病毒 Ⅰ 型 （ ｐｏｒｃｉｎｅｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓｔｙｐｅｌ ， ＰＣＶ１ ） 和有致病性的猪圆环病毒 Ⅱ 型 （ ｐｏｒｃｉｎｅｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓｔｙｐｅ２ ， ＰＣＶ２ ）。 ＰＣＶ２ 是引发仔猪断奶后多 系统衰弱综合征 （ ｐｏｓｔｗｅａｎｉｎｇｍｕｌｔｉｓｙｓｔｅｍｗａｓｔｉｎｇｓｙｎｄｒｏｍｅ ， ＰＭＷＳ ） 的主要病原 。 该病主要以患畜 生长迟缓 、 进行性消瘦和多系统病理损伤为特征 ， 给世界各国主要养猪地区的规模化养猪业造成了一定 的经济损失 。 Ⅱ 犌犅 ／ 犜 ２１６７４ — ２００８ 猪圆环病毒聚合酶链反应试验方法 １ 　 范围 本标准规定了猪圆环病毒 （ ＰＣＶ ） 聚合酶链反应 （ ＰＣＲ ） 检测方法的技术要求 。 本标准适用于猪血清和组织中的猪圆环病毒检测 ， 以及其 Ⅰ 型 （ ＰＣＶ１ ） 和 Ⅱ 型 （ ＰＣＶ２ ） 的鉴别 。 ２ 　 实验室生物安全要求 试验操作应在生物安全 Ⅱ 级 （ ＢＳＬ２ 级 ） 以上的实验室进行 。 ３ 　 实验材料 、 仪器设备和试剂 ３ ． １ 　 实验材料 眼科剪 、 眼科镊 、 称量纸 、 １０ｍＬ 一次性注射器 、 １．５ｍＬ 灭菌离心管 、 ０．２ｍＬ 薄壁 ＰＣＲ 管 、 琼脂糖 、 ５００ｍＬ 量筒 、 ５００ｍＬ 锥形瓶 、 吸头 （ １０ μ Ｌ 、 ２００ μ Ｌ 、 １０００ μ Ｌ ）、 灭菌双蒸水 。 ３ ． ２ 　 仪器设备 分析天平 、 高速离心机 、 真空干燥器 、 ＰＣＲ 扩增仪 、 电泳仪 、 电泳槽 、 紫外凝胶成像仪 （ 或紫外分析 仪 ）、 液氮罐或 －７０℃ 冰箱 、 微波炉 、 组织研磨器 、 －２０℃ 冰箱 、 水浴锅 、 可调移液器 （ 最大量程为 ２ μ Ｌ 、 ２０ μ Ｌ 、 ２００ μ Ｌ 、 １０００ μ Ｌ ）。 ３ ． ３ 　 试剂 本标准所用试剂 ， 除特殊标注外 ， 均为分析纯 。 ３ ． ３ ． １ 　 消化液 （ 见第 Ａ．１ 章 ）。 ３ ． ３ ． ２ 　 ２％ 蛋白酶 Ｋ 溶液 （ 见第 Ａ．２ 章 ）。 ３ ． ３ ． ３ 　 酚  三氯甲烷  异戊醇混合液 （ 见第 Ａ．３ 章 ）。 ３ ． ３ ． ４ 　 ２．５ｍｍｏｌ ／ ＬｄＮＴＰ （ 见第 Ａ．４ 章 ）。 ３ ． ３ ． ５ 　 １０ｐｍｏｌ ／ μ ＬＰＣＶ 引物 （ 见第 Ａ．５ 章 ）。 ３ ． ３ ． ６ 　 ０．５Ｕ ／ μ ＬＴａｑＤＮＡ 聚合酶 （ 见第 Ａ．６ 章 ）。 ３ ． ３ ． ７ 　 １０ 倍 ＰＣＲ 缓冲液 （ 见第 Ａ．７ 章 ）。 ３ ． ３ ． ８ 　 溴化乙锭 （ ＥＢ ） 溶液 （ 见第 Ａ．８ 章 ）。 ３ ． ３ ． ９ 　 电泳缓冲液 （ ５０ 倍 ）（ 见第 Ａ．９ 章 ）。 ３ ． ３ ． １０ 　 １％ 琼脂糖凝胶 （ 见第 Ａ．１０ 章 ）。 ３ ． ３ ． １１ 　 上样缓冲液 （ 见第 Ａ．１１ 章 ）。 ３ ． ３ ． １２ 　 异丙醇 。 ３ ． ３ ． １３ 　 ７５％ 乙醇 （ 见第 Ａ．１２ 章 ）。 ３ ． ３ ． １４ 　 １５ｍｍｏＬ ／ Ｌ 氯化镁 （ 见第 Ａ．１３ 章 ）。 ３ ． ３ ． １５ 　 灭菌双蒸水 （ 见第 Ａ．１４ 章 ）。 ３ ． ３ ． １６ 　 电泳缓冲液 （ １ 倍 ）（ 见第 Ａ．１５ 章 ）。 ４ 　 操作程序 ４ ． １ 　 样品的采集与处理 ４ ． １ ． １ 　 样品的采集 ： 濒死猪 、 扑杀的成年猪和流产胎儿取肺脏和淋巴结 ； 幼龄猪取心脏 ； 待检活猪 ， 用 注射器取血 ２ｍＬ ～ ４ｍＬ ， 立即送往实验室 。 １ 犌犅 ／ 犜 ２１６７４ — ２００８ ４ ． １ ． ２ 　 样品的处理 ： 每份样品分别处理 ４ ． １ ． ２ ． １ 　 组织样品处理 ： 取待检病料约 ０．２ｇ 置研磨器中剪碎并研磨 ， 加入 ２ｍＬ 消化液 （ ３．３．１ ） 继续 研磨 。 取已研磨好的待检病料上清 １００ μ Ｌ ， 置 １．５ｍＬ 灭菌离心管中 ， 再加入 ５００ μ Ｌ 消化液 （ ３．３．１ ） 和 １０ μ Ｌ２％ 蛋白酶 Ｋ 溶液 （ ３．３．２ ）， 混匀后 ， 置 ５５℃ 水浴中 ４ｈ ～ １６ｈ 。 ４ ． １ ． ２ ． ２ 　 血清样品处理 ： 待血液凝固后 ， 取上清放于离心管中 ， ４℃８０００ 犵 离心 ５ｍｉｎ ， 取上清 １００ μ Ｌ ， 置 １．５ｍＬ 灭菌离心管中 ， 加入 ５００ μ Ｌ 消化液 （ ３．３．１ ） 和 １０ μ Ｌ２％ 蛋白酶 Ｋ 溶液 （ ３．３．２ ）， 混匀 ， 置 ５５℃ 水浴中 ４ｈ ～ １６ｈ 。 ４ ． １ ． ２ ． ３ 　 阳性对照处理 ： 分别取 ＰＣＶ１ 和 ＰＣＶ２ 细胞培养液各 １００ μ Ｌ ， 置 １．５ｍＬ 灭菌离心管中 ， 每 管加入 ５００ μ Ｌ 消化液 （ ３．３．１ ） 和 １０ μ Ｌ２％ 蛋白酶 Ｋ 溶液 （ ３．３．２ ）， 混匀 ， 置 ５５℃ 水浴中 ４ｈ ～ １６ｈ 。 ４ ． １ ． ２ ． ４ 　 阴性对照处理 ： 取灭菌双蒸水 １００ μ Ｌ ， 置 １．５ｍＬ 灭菌离心管中 ， 加入 ５００ μ Ｌ 消化液 （ ３．３．１ ） １０ μ Ｌ２％ 蛋白酶 Ｋ 溶液 （ ３．３．２ ）， 混匀 ， 置 ５５℃ 水浴中 ４ｈ ～ １６ｈ 。 ４ ． ２ 　 犇犖犃 模板的提取 ４ ． ２ ． １ 　 取出已处理的待检样品及阴性 、 阳性对照样品 ， 每管加入 ６００ μ Ｌ 酚  三氯甲烷  异戊醇混合液 （ ３．３．３ ）， 用力颠倒 １０ 次混匀 ， １３０００ 犵 离心 １０ｍｉｎ 。 ４ ． ２ ． ２ 　 取上清 ５００ μ Ｌ 置 １．５ｍＬ 灭菌离心管中 ， 加入等体积异丙醇 （ ３．３．１２ ）， 混匀 ， 置液氮中 ３ｍｉｎ 或 －７０℃ 冰箱中 ３０ｍｉｎ 。 取出离心管 ， 室温融化 ， ４℃２００００ 犵 离心 １５ｍｉｎ 。 ４ ． ２ ． ３ 　 弃上清 ， 沿离心管开口方向管壁缓缓滴入 １ｍＬ－２０℃ 预冷的 ７５％ 乙醇 （ ３．３．１３ ） 溶液 ， 轻轻旋 转洗一次后倒掉 ， 将离心管倒扣于吸水纸上 １ｍｉｎ ， 真空抽干 １５ｍｉｎ 。 ４ ． ２ ． ４ 　 取出离心管 ， 用 ５０ μ Ｌ 灭菌双蒸水溶解沉淀 ， 作为模板备用 。 ４ ． ３ 　 犘犆犚 扩增 每管取灭菌双蒸水 ８ μ Ｌ ， ２．５ｍｍｏｌ ／ ＬｄＮＴＰ （ ３．３．４ ）、 １０ｐｍｏｌ ／ μ ＬＰＣＶ 引物 （ ３．３．５ ）、 １５ｍｍｏｌ ／ Ｌ 氯化镁 （ ３．３．１４ ）、 １０ 倍 ＰＣＲ 缓冲液 （ ３．３．７ ）、 ０．５Ｕ ／ μ ＬＴａｑＤＮＡ 聚合酶 （ ３．３．６ ） 各 ２ μ Ｌ ， ＤＮＡ 模板 ２ μ Ｌ ， 混匀 ， 作好标记 ， 加入矿物油约 ２０ μ Ｌ ， 覆盖 （ 有热盖的自动 ＤＮＡ 热循环仪不用加矿物油 ）。 扩增 条件为 ９４℃３０ｓ 、 ６２℃４５ｓ 、 ７２℃４５ｓ ， ３５ 个循环后 ， ７２℃ 延伸 １０ｍｉｎ 。 ４ ． ４ 　 电泳 将 ＰＣＲ 扩增产物 １５ μ Ｌ 与 ３ μ Ｌ 上样缓冲液 （ ３．３．１１ ） 混合 ， 点样于 １％ 琼脂糖凝胶 （ ３．３．１０ ） 孔中 ， 琼脂糖凝胶板一侧点样孔加入 １００ｂｐＬａｄｄｅｒＭａｒｋｅｒ （ 分子质量标准物 ）， 以 ５Ｖ ／ ｃｍ 电压电泳 ４０ｍｉｎ ， 紫外凝胶成像仪下观察结果 。 ５ 　 结果判定 当 ＰＣＶ１ 阳性对照出现 ６５２ｂｐ 扩增带 ， ＰＣＶ２ 阳性对照出现 １１５４ｂｐ 扩增带 ， 阴性对照未出现 目的带时 ， 实验结果成立 。 被检样品出现 ６５２ｂｐ 扩增带为 ＰＣＶ１ 阳性 ， 出现 １１５４ｂｐ 扩增带为 ＰＣＶ２ 阳性 ， 未出现相应扩增带的样品判为阴性 。 ２ 犌犅 ／ 犜 ２１６７４ — ２００８ 附 　 录 　 犃 （ 规范性附录 ） 试剂的配制 犃 ． １ 　 消化液 犃 ． １ ． １ 　 １ 犿狅犾 ／ 犔 三羟甲基氨基甲烷  盐酸 （ 犜狉犻狊犎犆犔 ）（ 狆犎 ８ ． ０ ） 　　 三羟基甲基氨基甲烷 　　　　　　　　　　　　　　　　　 １２．１１ｇ 灭菌双蒸水 　　　　　　　　　 ８０ｍＬ 浓盐酸 调 ｐＨ 至 ８．０ 灭菌双蒸水 加至 １００ｍＬ 犃 ． １ ． ２ 　 ０ ． ５ 犿狅犾 ／ 犔 乙二铵四乙酸二钠 （