ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T31787—2015 香石竹环斑病毒分子生物学检测方法 MoleculardetectionofCarnationringspotvirus 2015-07-03发布 2015-11-27实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国天津出入境检验检疫 局、上海市标准化研究院、中华人民共和国珠海出入境检验检疫局。 本标准主要起草人:杨翠云、于翠、魏亚东、杨瑞钰、张卫东、郭京泽、胡培龙、崔学慧。 ⅠGB/T31787—2015 香石竹环斑病毒分子生物学检测方法 1 范围 本标准规定了香石竹环斑病毒的RT-PCR、IC-RT-PCR和实时荧光RT-PCR等分子生物学检测 方法。 本标准适用于植物种苗中携带的香石竹环斑病毒的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 SN/T1193 基因检验实验室技术要求 SN/T2122 进出境植物及植物产品检疫抽样 3 仪器设备、用具和试剂 3.1 仪器设备 PCR仪、实时荧光定量PCR仪、超净工作台、电子天平(1/10000g)、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系 统、水浴锅、高速冷冻离心机、-80℃超低温冰箱、高压灭菌锅、制冰机、微波炉、漩涡振荡器。 3.2 用具 可调式微量移液器(2μL、10μL、100μL、200μL、1000μL)及相应的无RNase吸头、无RNase离 心管、PCR管和研钵等。 3.3 试剂 RT-PCR试剂(见附录B),IC-RT-PCR试剂(见附录C)。 4 症状观察及抽样 4.1 症状观察 现场检疫主要观察进境植物材料上病毒为害的症状,CRSV为害症状描述参见附录A。 4.2 抽样 发现有病毒为害症状的植物材料直接送检;未发现症状的,则按SN/T2122中规定进行抽样,并送 实验室进行病毒检测鉴定。 5 病毒检测 5.1 RT-PCR方法 将送检植物样品中有疑似病毒为害症状的植物组织液氮研细,取0.1g用于提取植物总RNA,然后 1GB/T31787—2015 反转录获得cDNA,再进行PCR反应。具体操作步骤见附录B。 5.2 免疫捕获RT-PCR方法(IC-RT-PCR) 将送检样品中有疑似病毒为害症状的植物组织放入研钵内研磨,并按重量和病毒抽提缓冲液 1∶10的比例稀释,制备的汁液分别盛装于离心管中,离心后吸取上清液作为待测样品。 用香石竹环斑病毒抗血清包被PCR管,洗涤后在PCR管中加入制备的待测样品,进行免疫捕获, 然后反转录获得cDNA,再进行PCR反应。具体操作步骤见附录C。 5.3 实时荧光RT-PCR方法 采用5.1或者5.2方法获得cDNA,进行实时荧光PCR反应。具体操作步骤见附录D。 6 防污染措施 香石竹环斑病毒分子生物学检测过程的防污染措施应符合SN/T1193的规定。制样用的研钵经 过洗涤液清洗后,160℃干热处理2h。 7 结果判定 样品经RT-PCR、IC-RT-PCR和实时荧光RT-PCR三种方法之一检测为阴性时,证明样品不携带 香石竹环斑病毒。 样品经RT-PCR或IC-RT-PCR检测为阳性,需要进行序列测定,如果序列测定结果证实与所检测 的香石竹环斑病毒一致,可判定样品携带香石竹环斑病毒。 样品经实时荧光RT-PCR检测为阳性时,也可判定样品携带香石竹环斑病毒。 8 样品保存和结果记录 8.1 样品保存 经检测确定携带香石竹环斑病毒的样品,应妥善保存在-80℃冰箱中。并做好登记和标记工作。 保存期满后,需经灭活处理。 8.2 结果记录 记录包括:样品来源、种类、取样人员、实验的时间、地点、方法和结果、检验检疫员的签字等。RT- PCR和IC-RT-PCR检测应有电泳结果照片及序列测定分析结果,实时荧光RT-PCR应有荧光曲线图 与Ct值。 2GB/T31787—2015 附 录 A (资料性附录) 香石竹环斑病毒背景资料 A.1 背景资料 A.1.1 香石竹环斑病毒基本信息 中文名:香石竹环斑病毒。 学 名:Carnationringspotvirus。 缩 写:CRSV。 分类地位:番茄丛矮病毒科(Tombusviridae),香石竹环斑病毒属(Dianthovirus)。 传播途径:该病毒通过无性繁殖材料的运输进行长距离传播,近距离主要是由于植物间的接触、土 壤污染和农事操作等引起病毒传播。尚未见种传报道。 A.1.2 方法原理 用特异性抗体吸附待测样品中的病毒粒子后经高温裂解释放出病毒RNA,或直接从待测样品材料 中提取植物总RNA,然后在逆转录酶的作用下合成cDNA,以cDNA为模板再通过普通PCR或实时荧 光PCR进行检测。分析PCR结果即可明确材料中是否含有香石竹环斑病毒的核酸成分。 A.2 寄主范围 香石竹环斑病毒的实验寄主范围较自然寄主广,在自然条件下,CRSV主要侵染香石竹,还可侵染 李树、梨树、苹果、葡萄、酸樱桃和甜樱桃等多种果树及果园里的杂草,如:繁缕。 在实验条件下,CRSV可侵染25科共133种植物,可系统侵染茄科、豆科和葫芦科的植物,非系统 侵染的寄主范围更广。 A.3 为害症状 CRSV侵染香石竹引起叶片环斑、斑驳,导致叶和花的扭曲及畸变,严重可致叶尖坏死。当CRSV与 香石竹斑驳病毒(Carnationmottlevirus)共同侵染时,症状加重。CRSV侵染果树的症状较轻且很难发现。 CRSV接种如下几种鉴别寄主可产生相应的症状,可用来作为该病毒的鉴定方法之一。 苋色藜(Chenopodiumamaranticolor)和昆诺藜(C.quinoa):接种叶出现局部褪绿或坏死斑,通常 无系统症状。 三生烟(Nicotianatabacumvar.SamsunNN):接种叶出现退绿环斑、枯斑及坏死斑,后期病斑连成 一片。 豇豆(Vignaunguiculatassp.Sinensis):接种叶产生局部坏死斑,接着系统感染叶产生斑驳、坏死 斑、叶片卷曲或脉缩。 美国石竹(Diathusbarbatus):接种叶产生环状病斑,接着为系统褪绿及坏死斑。 千日红(Gomphrenaglobosa):接种叶产生局部坏死环斑,接着系统感染叶产生病斑、斑驳和畸形。 菜豆(Phaseolusvulgaris):接种叶产生局部坏死斑,接着叶变白、坏死,产生不规则系统斑,坏死叶 3GB/T31787—2015 脉斑,最后无症带毒。 番杏(Tetragoniaexpansa):接种后叶片产生局部白斑,有时也产生系统坏死斑。 A.4 分布 欧洲:丹麦、芬兰、法国、德国、意大利、立陶宛、荷兰、波兰和英国。 美洲:巴西、加拿大、哥伦比亚、墨西哥和美国。 大洋洲:澳大利亚和新西兰。 A.5 病毒粒体形态 病毒粒体为直径34nm的正二十面体(T=3),由180个分子质量为37900u的蛋白亚基组成病毒 粒子外壳。 A.6 基因组 基因组由RNA-1和RNA-2两条单链RNA分子组成,分别为3.8kb和1.4kb。RNA-1在缺少 RNA-2时可单独在植物原生质体中进行复制,但侵染植物需RNA-1和RNA-2的共同作用。 4GB/T31787—2015 附 录 B (规范性附录) RT-PCR方法 B.1 试剂 B.1.1 RNA提取试剂 Trizol裂解液、三氯甲烷、异丙醇、75%乙醇。 B.1.2 反转录试剂 AMV反转录酶(5U/μL)、5×AMV酶缓冲液、dNTP(10mmol/L)、RNA酶抑制剂(40U/μL)。 B.1.3 PCR试剂 10×PCR缓冲液、氯化镁(25mmol/L)、dNTP(10mmol/L)、TaqDNA聚合酶(5U/μL)。 B.1.4 50×TAE Tris 242g 冰乙酸 52.1mL 0.5mol/LEDTA 100mL 用时加蒸馏水稀释至1×TAE。 B.2 实验步骤 B.2.1 引物序列 上游引物:CRSV-F:5’-CCGATGTGCCCAAGTATGT-3’; 下游引物:CRSV-R:5’-GGCTATGACGCCGTGAAT-3’; 扩增片段长度406bp。 B.2.2 RNA提取 取适量待测样品液氮研细,然后取0.1g磨碎的样品放入1.5mL离心管中,加入1mLTrizol,混 匀;加入0.2mL三氯甲烷,猛烈振荡15s,4℃11000r/min离心10min,小心吸取上层无色水相到新 离心管中;加入等体积异丙醇,混匀,-20℃静置10min,4℃12000r/min离心15min,保留沉淀;加 入1mL75%冷乙醇,悬浮沉淀,4℃8000r/min离心10min,干燥沉淀;加入30μLDEPC-H2O,溶解 沉淀(必要时,55℃~60℃水浴10min,加速溶解),存于-80℃备用。 或者按照植物总RNA提取试剂盒说明书进行操作。 B.2.3 反转录 反应体系及反应条件见表B.1,试剂加样量可根据具体情况进行适当调整。也可采用RT-PCR一 步法试剂盒,操作步骤按使用说明进行。 5GB/T31787—2015 表B.1 反转录反应体系与反应条件 名称 储存液浓度 终浓度 加样量/μL 下游引物