ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T31807—2015 棉花根腐病菌检疫鉴定方法 DetectionandidentificationofPhymatotrichopsisomnivora(Duggar)Hennebert 2015-07-03发布 2015-11-27实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国宁波出入境检验检疫局、中华人民共和国珠海出入境检验检疫 局、中国检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人:张慧丽、张卫东、段维军、徐瑛、陈先锋、崔俊霞、杜洪忠、吴品珊。 ⅠGB/T31807—2015 棉花根腐病菌检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了棉花根腐病菌的检疫鉴定方法。 本标准适用于棉花根腐病寄主植物的植株、种子及介质的检疫鉴定。 2 仪器设备和主要试剂 2.1 仪器设备 显微镜、解剖镜、天平(感量1/100g,1/10000g)、pH计、制冰机、纯水仪、涡旋振荡器、台式离心 机、高速冷冻离心机、低温冰箱、冷藏冷冻冰箱、超净工作台、PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像仪、 微量移液器(2μL、20μL、100μL、200μL、1000μL)。 2.2 主要试剂 除另有规定外,所有试剂均采用分析纯。包括无菌双蒸水、次氯酸钠、液氮、蛋白酶K、氯化镁、氢氧 化钠、醋酸铵、氯化钾、无水乙醇、溴化乙锭、三氯甲烷、异丙醇、异戊醇、TaqDNA聚合酶、dNTP混合 物、10×PCR缓冲液、琼脂糖、DNA相对分子质量标准物、CTAB、Tris/EDTA/SDS提取缓冲液 (TES)、Tris硼酸盐EDTA缓冲液(TBE)、Tris/EDTA缓冲液(TE)等。分离培养基、产孢培养基、马 铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)配制方法及步骤见附录C。 3 病菌的鉴定 3.1 症状检查 将可疑植株的根部在解剖镜下镜检,将带有菌丝索或菌核的病根挑出。种子类样品,从中挑选夹带 的植株残体,尤其是根部病残体。介质土借助湿筛挑出其中的菌核(参见附录B)。 3.2 病原菌的分离培养 3.2.1 病根上菌丝索的分离培养 在解剖镜下,将病根上覆盖的菌丝索挑下,用无菌水洗涤菌丝片段,洗净后置于分离培养基上, 28℃黑暗培养,每天观察,待长出菌丝后,挑取菌丝尖端转移到PDA平板上纯化。 3.2.2 病残体上病原菌的分离培养 在自来水下将病残体洗净,切取病健交界处组织,用1%次氯酸钠进行表面消毒3min,无菌水冲洗 3次,灭菌滤纸吸干表面水分后,置于分离培养基上,28℃黑暗培养,每天观察,待长出菌丝后,挑取菌 丝尖端转移到PDA平板上纯化。 3.2.3 菌核上病原菌的分离培养 菌核上病原菌的分离培养方法同3.2.2。 1GB/T31807—2015 3.3 分生孢子的诱导 将纯化好的菌株接种到产孢培养基上,28℃,每天光照16h。每天观察,待产孢后,显微镜下观察 分生孢子的形态特征。 3.4 PCR鉴定方法 PCR鉴定方法见附录D。 4 鉴定特征 4.1 症状特点 寄主植物受侵染后,根的表面覆盖有棕褐色至金黄色菌丝索(参见B.1),根部变软、腐烂、皮层易剥 落,中柱变色或出现红褐色病斑(参见B.1),有时根表面还可以看到棕色至黑色的菌核。 4.2 病菌的形态特征 病菌在PDA平板上菌落初为白色,后变为污黄色(参见B.2)。分生孢子梗球形或椭圆形,大小 (12μm~20μm)×(20μm~30μm),少数情况下分生孢子梗呈棍棒状或串珠状,其顶部产生分生孢 子,外观上类似“担子”(参见B.2)。分生孢子单胞,透明,球形或卵圆形,着生于多分枝的菌丝上,直径 4.8μm~5.5μm或(6μm~8μm)×(5μm~6μm)(参见B.2)。菌丝索褐色,直径约200μm,成直角伸 出侧枝,侧生菌丝呈十字形分枝(参见B.2)。菌核棕色或黑色,圆形或不规则形,直径1mm~5mm,单 生或串生,萌发后长白色菌丝,后变污黄色(参见B.3)。 4.3 PCR特异性扩增 P.omnivora的特异性扩增片段为627bp。 5 结果判定 根据棉花根腐病菌的为害症状及病原菌形态特征对病菌分离物进行综合判定,分离物的为害症状 及形态特征与第4章各项鉴定指标吻合,判定为棉花根腐病菌,分离物的为害症状及形态特征不明显的 情况下,分离物需要进行PCR鉴定,PCR特异性扩增阳性,可判为棉花根腐病菌。 6 样品保存与结果记录 6.1 样品保存与处理 经检验确定携带棉花根腐病菌的样品,视样品的状态采用相应的保存方式,妥善保存6个月,以备 复核。保存期满后,应经灭菌处理。 6.2 菌株保存与处理 从检测样品中分离并鉴定为棉花根腐病菌的菌株,应妥善保存。对不需要长期保存的菌株应及时 高压灭菌处理。 2GB/T31807—2015 6.3 结果记录与资料保存 需要保存的记录包括:样品的种类、自然状态、来源、被为害症状及为害程度(无症状也要说明),诊 断时使用的方法(包括质控物质,以及每种方法获得的结果),PCR检测应有电泳结果照片,鉴定实验室 的名称,负责人和鉴定人的签字等。 3GB/T31807—2015 附 录 A (资料性附录) 棉花根腐病菌相关信息 A.1 背景资料 A.1.1 棉花根腐病菌基本信息 学名:Phymatotrichopsisomnivora(Duggar)Hennebert 异名:PhymatotrichumomnivorumDuggar,OzoniumomnivorumShear,Ozoniumauricomum Link 英文名:Phymatotrichumrootrot,Texasrootrot 分类地位:半知菌门(Deuteromycota),丝孢纲(Hyphomycetes),丝孢目(Moniliales),淡色孢科 (Moniliaceae),拟瘤梗孢属(Phymatotrichopsis)。 传播途径:病原菌可通过病根、混有病残体和菌核的土壤等进行远距离传播。 近似种:波状根盘菌(Rhizinaundulata)引起的松苗根腐病,在地下产生菌丝索,覆盖在受侵染的 根表面,与棉花根腐病引起的症状相似,但是波状根盘菌在子囊盘上形成子囊孢子,孢子纺锤形或棱形, 无分隔,两端突尖,含两个小油滴。 A.1.2 方法原理 根据棉花根腐病菌在寄主植物上的症状,对病原菌进行分离培养,采用形态学和分子生物学方法对 病原菌进行鉴定(参见附录B、附录C)。 A.2 地理分布 非洲:利比亚。 北美洲:墨西哥(北部)和美国(西南部的9个州,包括亚利桑那州、阿肯色州、加利福尼亚州、路易斯 安那州、内华达州、新墨西哥州、俄克拉荷马州、得克萨斯州、犹他州)。 中美洲:多米尼加共和国。 南美洲:委内瑞拉。 A.3 寄主 主要寄主是棉花,还可以侵染2300多种双子叶植物,但不侵染单子叶植物(参见表A.1)。 表A.1 棉花根腐病菌的寄主 学名 中文名 Abeliachinensis 糯米条 Abelia×grandiflora 大花糯米条 Abutilonincanum 苘麻属一种 Abutilontheophrasti 苘麻学名 中文名 Acaciafarnesiana 金合欢 Acaciagreggii 猫爪相思树 Acalyphasp. 铁苋菜属 Acanthopanaxsieboldianus 异株五加 4GB/T31807—2015 表A.1(续) 学名 中文名 Acernegundo 梣叶槭 Acersaccharinum 银白槭 Acersaccharophorum 糖枫 Achilleamillefolium 蓍 Achraszapota 人心果 Acnidatamariscina 异株苋亚属一种 Aconitumsp. 乌头属 Aesculushippocastanum 欧洲七叶树 Aesculuspavia 红花七叶树 Aesculussp. 七叶树属 Agrimoniapubescens 龙芽草属一种 Agrimoniasp. 龙芽草属 Agrostemmagithago 麦仙翁 Ailanthusaltissima 臭椿 Aleuritesfordii 油桐 Allioniasp. 紫茉莉科一种 Alnusglutinosa 欧洲桤木 Alnusrubra 赤桦木 Alnustenuifolia 薄叶桤木 Althaearosea 蜀葵 Amaranthuscaudatus 尾穗苋 Amaranthusgraecizans 匍匐苋 Amaranthusretroflexus 反枝苋 Amaranthussp. 苋属 Amaranthusspinosus 刺苋 Ambrosiaartemisiifolia 豚草 Ambrosiabidentata 二裂叶豚草 Ambrosiapsilostachya 多年生豚草 Ambrosiatrifida 三裂叶豚草 Amelanchieralnifolia 桤叶唐棣 Amorphasp. 紫穗槐属 Anethumgraveolens 莳萝 Angelicasp. 当归属 Annonasquamosa 番荔枝学名 中文名 Anthemisarvensis 田春黄菊 Anthemiscotula 臭春黄菊 Antirrhinummajus 金鱼草 Apiosamericana 土栾儿 Apocynumandrosaemifolium 美国茶叶花