ICS13.300 CCSA80 中华人民共和国国家标准 GB/T21769—2025 代替GB/T21769—2008 化学品 体外3T3中性红摄取 光毒性试验方法 Chemicals—Invitro3T3NRUphototoxicitytestmethod 2025-10-05发布 2026-02-01实施 国家市场监督管理总局 国家标准化管理委员会发布前 言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件代替GB/T21769—2008《化学品 体外3T3中性红摄取光毒性试验方法》,与GB/T21769—2008 相比,除结构调整和编辑性改动外,主要技术内容变化如下: a) 将“试验基本原则”更改为“试验原理”,更改了实验时关于光照处理时间的要求(见第5章, 2008年版的第4章); b) 更改了摩尔消光系数的值(见6.1.1,2008年版的5.1.1); c) 将“新陈代谢系统”更改为“代谢活化系统”,更改了试验中对代谢系统的要求(见6.1.3,2008年 版的5.1.3); d) 增加了“试验准备”中,试验细胞选择的要求(见6.2.1),培养条件二氧化碳浓度调整的内容(见 6.2.2),受试物系列稀释溶液配制内容(见6.2.4),光源的全波段光谱波长范围和对UVA-照度 计定期校准的要求(见6.2.5); e) 删除了试验准备中细胞株来源的内容(见2008年版的5.2.1),受试化学物质制备有关选用弱 性缓冲液时细胞二氧化碳培养条件的要求和阴性对照组的内容(见2008年版的5.2.4),阴性 对照组光敏检查的内容(见2008年版的5.4.2); f) 增加了受试物浓度有关最高浓度降低至100μg/mL的内容(见6.3.1.2); g) 将“阴性对照组”更改为“溶剂对照组”,更改了绝对光密度值的数值(见6.4.3,见2008年版的 5.4.3); h) 增加了“避免中性红溶液结晶”的内容(见6.4.4); i) 更改了试验步骤中细胞培养时间、孵育过夜时间、测定波长的要求(见6.5,2008年版的5.5); j) 增加了中性红溶液配制方式内容、试验使用水的要求(见6.5.3.2); k) 更改了光刺激因子(PIF)计算公式(见7.2.3,2008年版的6.2.3)、MPE临界值的要求(见 7.2.4,2008年版的6.2.4); l) 删除了计算PIF和MPE软件获取方式的内容(见2008年版的6.2.5); m) 更改了试验结果预测模型的内容(见7.3.1,2008年版的6.3.1)、参考化学物质中文名称的内容 (见表2,2008年版的表1)、阴性结果PIF的要求(见7.3.4,2008年版的6.3.3)。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由全国危险化学品管理标准化技术委员会(SAC/TC251)提出并归口。 本文件起草单位:广州海关技术中心、宁波海关技术中心、中检科健(天津)检验检测有限责任公司。 本文件主要起草人:温巧玲、潘丙珍、鲍佳生、潘芳、李志勇、陈德明、黄丽霞、黄雄俊、张梓龙、席静、 刘汉伟、易蓉、陈文锐、郑建国、谢文平。 本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为: ———2008年首次发布为GB/T21769—2008; ———本次为第一次修订。 ⅠGB/T21769—2025 化学品 体外3T3中性红摄取 光毒性试验方法 1 范围 本文件确立了化学品体外3T3中性红摄取光毒性试验的原理,规定了试验结果和试验报告的内容 要求,描述了试验方法。 本文件适用于化学品进行光毒性的筛选和检测的试验。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 辐照度 irradiance 入射到某一表面的紫外线(UV)或可见光(Vis)的强度。 注:单位为瓦每平方米(W/m2)或毫瓦每平方厘米(mW/cm2)。 3.2 光剂量 doseoflight 入射到某一表面的紫外线或可见光的量(强度与时间的乘积)。 注:以单位表面积的焦耳数表示,即焦耳每平方米(J/m2)或焦耳每平方厘米(J/cm2)。 3.3 紫外线波长 ultravioletlightwavebands 在生物学实验中,紫外线波长为100nm~400nm的光波。 注:国际照明委员会(CommissionInternationaledeL’Eclairage,CIE)推荐的名称为:UVA(315nm~400nm)、 UVB(280nm~315nm)和UVC(100nm~280nm)。UVB和UVA的分界线通常在320nm,UVA可在 340nm处分为UV-A1和UV-A2。 3.4 细胞活性 cellviability 测量某一细胞群总活性的参数(如细胞溶酶体摄取活性染料中性红),其数值取决于测定的终点和 试验所用的设计方案,并与细胞总数和/或细胞活力相关。 3.5 光刺激因子 photoirritationfactor;PIF 受试物分别在无光照(-Irr)和有光照[+Irr,无细胞毒性的紫外线/可见光(UV/Vis)照射]条件下 1GB/T21769—2025 获得两组平行有效的细胞毒性浓度(IC50)通过计算得到的比值。 3.6 相对细胞活性 relativecellviability 与溶剂(阴性)对照组的相关性来表达的细胞活性。 注:对照组除了未经受试物处理外,整个试验过程与试验组一样(+Irr或-Irr)。 3.7 半数抑制浓度 halfmaximalinhibitoryconcentration;IC50 使细胞活性下降50%的受试物的浓度。 3.8 平均光效应 meanphotoeffect;MPE 受试物分别在无光照(-Irr)和有光照[+Irr,无细胞毒性的紫外线/可见光(UV/Vis)照射]条件下 获得两组浓度反应曲线通过数学分析导出的数值。 3.9 光毒性 phototoxicity 皮肤首次接触或全身应用某些化学物质继而暴露于光下所引发的急性毒性反应。 3.10 混合物 mixture 两种或两种以上不发生反应的化学物质组成的物质。 3.11 摩尔消光系数 molarextinctioncoefficient;MEC 摩尔吸收系数 molarabsorptioncoefficient 在一组特定条件(如溶剂、温度和波长)下,反映给定分子吸收光子效率的常数。 注:单位为升每摩尔厘米,即L/(mol·cm)。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 CPZ:氯丙嗪(Chlorpromazine) DMSO:二甲基亚砜(DimethylSulfoxide) EBSS:厄尔氏平衡盐溶液(Earle’sBalancedSaltSolution) HBSS:汉克斯平衡盐溶液(Hanks’BalancedSaltSolution) NR:中性红(NeutralRed) NRU:中性红摄取(NeutralRedUptake) ROS:活性氧(ReactiveOxygenSpecies) UV/Vis:紫外线/可见光(Ultraviolet/VisibleLight) 5 试验原理 5.1 体外3T3中性红摄取(NRU)光毒性试验用于鉴别被光激活的受试物的潜在光毒性。 5.2 试验中的细胞毒性是以受试物和光照射处理18h~24h后,与受试物浓度相关的活性染料中性红 (NR,CAS号:553-24-2)摄取量来表示的。NR是一种弱的阳离子染料,极易以非离子扩散的方式穿透 细胞膜并在细胞溶酶体内聚集。NR在pH接近中性的细胞质中不带电,但当其处于低pH的溶酶体腔 内时会变成正电荷。维持细胞溶酶体腔的低pH值,需要腺嘌呤核苷三磷酸(Adenosine 2GB/T21769—2025 Triphosphate,ATP),并且有赖于溶酶体膜的完整性。光毒性物质可以通过形成活性氧(ROS)和其他 机制,导致溶酶体膜的通透性增加、pH梯度降低,以及其他不可逆的变化,从而诱导细胞损伤,导致细 胞吸收和键合NR的能力下降从而区分活的、损伤的或死亡的细胞。 5.3 试验通过测定有光照(+Irr)和无光照(-Irr)条件下,永生化小鼠成纤维细胞系BALB/c3T3经 受试物作用后摄取活性染料NR能力的变化,计算受试物的光刺激因子(PIF)或平均光效应(MPE),以 此来判断受试物是否具有光毒性。 6 试验方法 6.1 试验前须知 6.1.1 光化学特性 许多种类的化学物质能诱导产生光毒性效应,它们的共同特点是在太阳光的波长范围内能够吸收 光能量。只有吸收足够的光量子才能发生光化学反应。因此,进行该试验前,宜按OECD试验指南101 (OECDTG101)的方法先测定受试物的UV/Vis吸收光谱。在适当的溶剂(如甲醇)中,如果化学物质 的摩尔消光系数(MEC)小于1000L/(mol·cm),则该化学物质不具有光反应性,无须进行体外3T3 中性红摄取光毒性试验,或其他测定不良光化学效应的生物学试验。通常情况下,该原则适用于所有受 试物,但有些化学物质根据其预期用途或可能的暴露条件,宜使用特定的指南(如药品按ICHS10测 试)。3T3NRU光毒性试验在化学物质光毒性连续试验中的作用,见附录A。 6.1.2